PCR引物設(shè)計的關(guān)鍵點有哪些？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計。那么你知道PCR引物設(shè)計的關(guān)鍵點有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

二、引物長度一般在15~30 堿基之間

引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。

三、引物GC 含量在40%~60%之間，Tm 值最好接近72℃

GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

四、引物3′端要避開密碼子的第3 位

如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。

五、引物3′端不能選擇A，最好選擇T

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A 時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T 時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯配的引發(fā)效率介于A、T 之間，所以3′端最好選擇T。

六、引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

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