蛋白表達(dá)的常見問題

蛋白表達(dá)實驗的時，有時候?qū)嶒灂X得參考實驗方法和克隆的蛋白基因序列完q沒有問題，但蛋白電泳就是沒有結(jié)果。那么你知道蛋白表達(dá)的常見問題有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！1、載體構(gòu)建錯誤，很多克隆新人常常弄錯讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其復(fù)制位點常有一兩個堿基的差異；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯誤，從而無法表達(dá)出來。2、宿主菌選擇不當(dāng)。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些經(jīng)過特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動子的載體，必須選擇適...

查看更多

PCR反應(yīng)體系包括什么

PCR是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過程，以擬擴(kuò)增的模板DNA分子，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過重復(fù)地變性一退火一延伸三步，擴(kuò)增新的目的DNA鏈，這個過程通過控制反應(yīng)體系的溫度來實現(xiàn)。那么你知道PCR反應(yīng)體系包括什么嗎？讓我們一起來看看吧！一、模板(template)模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來源DNA(如基因組DNA、質(zhì)粒DNA等)或RNA(如總RNA、...

查看更多

為什么qPCR提RNA不提DNA

定量PCR（qPCR）是一種在PCR反應(yīng)中實時監(jiān)測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。為什么qPCR提RNA不提DNA？RNA更能反映gene的表達(dá)水平依據(jù)中心法則，細(xì)胞內(nèi)的DNA序列首先被轉(zhuǎn)錄成RNA分子，特別是信使RNA（mRNA），隨后mRNA攜帶遺傳信息，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。mRNA的豐度和多樣性是衡量基因表達(dá)水平的關(guān)鍵指標(biāo)，它們直接關(guān)聯(lián)到特定基因在特定時間和條件下的活性。與蛋白質(zhì)相比，RNA的水平變化能夠更快地反映基因表達(dá)的動態(tài)變化，因為RNA的穩(wěn)定性相對較低，其水平變化可以迅速...

查看更多

RNA和WB蛋白的關(guān)系是怎樣的？

qRT-PCR（定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）和Westernblot（蛋白質(zhì)印跡法）是兩種常用的生物分子檢測技術(shù)，它們分別用于檢測mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。雖然蛋白質(zhì)是由mRNA翻譯而來，但mRNA的表達(dá)水平總是與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平一致嗎？做實驗任何一個結(jié)果如果你驗證了幾遍都是一樣，那么請不要懷疑自己，也許不是你做錯了，試圖去解釋這種現(xiàn)象!蛋白表達(dá)和RNA水平不一致的原因有：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：mRNA在轉(zhuǎn)錄后可以經(jīng)歷多種調(diào)控過程，如剪接、編輯、降解和穩(wěn)定性調(diào)控。這些過程可以影響mRNA...

查看更多

加藥處理的細(xì)胞如何換液？

加藥處理的細(xì)胞換液，需要遵循一定的操作步驟，確保實驗環(huán)境的無菌以及細(xì)胞的健康生長。以下是換液的一般步驟：1換液時間：一般建議每24或者48小時換液一次。2準(zhǔn)備新的培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞類型和生長需求，選擇合適的培養(yǎng)基。確保培養(yǎng)基新鮮、無菌，并在使用前預(yù)熱至37℃。收集舊培養(yǎng)基：輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使舊培養(yǎng)基充分混合。使用移液器將舊培養(yǎng)基收集到廢液缸。注意不要觸碰到細(xì)胞表面。3添加新培養(yǎng)基：將收集到的舊培養(yǎng)基丟棄，向培養(yǎng)瓶中加入新的培養(yǎng)基。確保新的培養(yǎng)基充分覆蓋細(xì)胞表面，避免氣泡產(chǎn)生，也...

查看更多